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Nature Microbiology volume 7, pagine 2128–2150 (2022)Citare questo articolo

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Nonostante i progressi nel sequenziamento, la mancanza di standardizzazione rende impegnativi i confronti tra gli studi e ostacola la comprensione della struttura e della funzione delle comunità microbiche in più habitat su scala planetaria. Qui presentiamo un'analisi multi-omica di un insieme diversificato di 880 campioni di comunità microbica raccolti per il progetto Earth Microbiome. Includiamo dati di sequenze metagenomiche di ampliconi (16S, 18S, ITS) e shotgun e dati di metabolomica non mirata (cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem e spettrometria di massa gascromatografica). Abbiamo utilizzato protocolli standardizzati e metodi analitici per caratterizzare le comunità microbiche, concentrandoci sulle relazioni e sulle co-occorrenze di metaboliti microbicamente correlati e taxa microbici nei diversi ambienti, permettendoci così di esplorare la diversità su scala straordinaria. Oltre a un database di riferimento per i dati metagenomici e metabolomici, forniamo un quadro per incorporare ulteriori studi, consentendo l'espansione delle conoscenze esistenti sotto forma di una risorsa comunitaria in evoluzione. Dimostriamo l'utilità di questo database testando l'ipotesi che ogni microbo e metabolita sia ovunque ma l'ambiente lo seleziona. I nostri risultati mostrano che la diversità dei metaboliti mostra turnover e nidificazione legati sia alle comunità microbiche che all’ambiente, mentre le abbondanze relative di metaboliti microbicamente correlati variano e co-si verificano con specifici consorzi microbici in modo specifico per l’habitat. Mostriamo inoltre il potere di alcuni elementi chimici, in particolare dei terpenoidi, nel distinguere gli ambienti terrestri (ad esempio, superfici e suoli di piante terrestri, feci di animali marini e d'acqua dolce), nonché quello di alcuni microbi tra cui Conexibacter woesei (terreni terrestri), Haloquadratum walsbyi (depositi marini) e Pantoea dispersa (detriti di piante terrestri). Questa risorsa fornisce informazioni dettagliate sui taxa e sui metaboliti all'interno delle comunità microbiche provenienti da diversi habitat sulla Terra, informando l'ecologia microbica e chimica e fornisce basi e metodi per studi multi-omici sul microbioma degli ospiti e dell'ambiente.

Uno degli obiettivi principali dell’ecologia microbica è comprendere la struttura delle comunità microbiche, come questa è correlata alla composizione tassonomica, filogenetica e funzionale dei microbi e come tali relazioni variano nello spazio e nel tempo. Poiché un singolo studio non è in grado di campionare ripetutamente tutti gli ambienti per consentire tali inferenze, è della massima importanza promuovere l'uso di metodi standardizzati che consentano la meta-analisi di studi distinti1,2,3,4. Gli sforzi iniziali si sono concentrati su protocolli standardizzati per il sequenziamento dell'RNA ribosomiale (rRNA) 16S delle comunità batteriche/archeologiche hanno fornito informazioni su come le comunità si strutturano nell'ambiente, supportando forti assi di separazione dei microbi lungo i gradienti di associazione dell'ospite e salinità1,5. Sforzi più recenti incentrati sui dati metagenomici6,7,8,9 hanno iniziato a fornire ulteriori informazioni sul potenziale funzionale nei diversi ambienti10,11,12,13,14 e gli attuali metodi all'avanguardia impiegano approcci multi-omici comprese metagenomica, trascrittomica, proteomica e/o metabolomica15,16,17,18,19,20,21,22,23,24.

I microbi producono diversi metaboliti secondari che svolgono funzioni vitali dalla comunicazione alla difesa25,26,27 e possono apportare benefici alla salute umana e alla sostenibilità ambientale28,29,30,31,32,33,34. Considerando che l'estrazione del metagenoma e la trascrittomica sono metodi efficaci per caratterizzare la funzione nelle comunità microbiche10,14,24, un approccio più potente per comprendere la diversità funzionale consiste nel generare prove chimiche che confermino la presenza di metaboliti19,20,21 e descrivano accuratamente la loro distribuzione sulla Terra. Qui presentiamo un approccio che valuta direttamente la presenza e l'abbondanza relativa dei metaboliti e fornisce una descrizione accurata dei profili dei metaboliti nelle comunità microbiche negli ambienti terrestri. Sebbene diversi studi abbiano precedentemente utilizzato la metagenomica e la metabolomica in tandem22,23,35,36,37,38,39,40, molti hanno utilizzato metodi tecnici relativamente limitati o hanno profilato un numero relativamente piccolo di classi di metaboliti23,35,40, impedendo il confronto tra gli studi ciò potrebbe ampliare la nostra comprensione. Inoltre, diversi studi precedenti sono limitati a un singolo ambiente o habitat20,23,24,35,36,37,38,39. Il nostro lavoro va sostanzialmente oltre quanto riportato in precedenza riguardo all’analisi multi-omica delle comunità microbiche utilizzando la metagenomica e la metabolomica, includendo più ecosistemi. L'approccio che applichiamo integra la metagenomica con un'indagine diretta dei metaboliti secondari utilizzando la metabolomica non mirata.

1.5–2 kb DNA fragments’ (Oxford Nanopore Technologies). The resulting product consists of uniquely tagged rRNA operon amplicons. The uniquely tagged rRNA operons were amplified in a second PCR, where the reaction (100 µl) contained 2 U Platinum SuperFi DNA Polymerase High Fidelity (Thermo Fisher) and a final concentration of 1X SuperFi buffer, 0.2 mM of each dNTP, and 500 nM of each forward and reverse synthetic primer targeting the tailed primers from above. The PCR cycling parameters consisted of an initial denaturation (3 min at 95 °C) and then 25–35 cycles of denaturation (15 s at 95 °C), annealing (30 s at 60 °C) and extension (6 min at 72 °C), followed by final extension (5 min at 72 °C). The PCR product was purified using the custom bead purification protocol above. Batches of 25 amplicon libraries were barcoded and sent for PacBio Sequel II library preparation and sequencing (Sequel II SMRT Cell 8M and 30 h collection time) at the DNA Sequencing Center at Brigham Young University. Circular consensus sequencing (CCS) reads were generated using CCS v.3.4.1 (https://github.com/PacificBiosciences/ccs) using default settings. UMI consensus sequences were generated using the longread_umi pipeline (https://github.com/SorenKarst/longread_umi) with the following command: longread_umi pacbio_pipeline -d ccs_reads.fq -o out_dir -m 3500 -M 6000 -s 60 -e 60 -f CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT -F AGRGTTYGATYMTGGCTCAG -r AATGATACGGCGACCACCGAGATC -R CGACATCGAGGTGCCAAAC -U ‘0.75;1.5;2;0’ -c 2./p>{sample_identifier}_{sequence_identifier}’), concatenated into a single fasta file and imported. We then used QIIME 2’s ‘vsearch’ plugin132 to dereplicate sequences and then cluster them at 65% similarity (that is, due to rapid evolution at bacterial ITS regions). The 65% OTU feature-table had 365 samples and 285 features. The concatenated fasta file and 65% OTU feature-table were uploaded to Qiita as distinct preparations (study: 13114). We then used QIIME 2’s90 ‘feature-table’ plugin to exclude singleton OTUs and samples with a total frequency of <500 reads, and the ‘deicode’91 plugin to estimate beta-diversity for each dataset using robust Aitchison distances91. The final feature-table for full-length rRNA operon beta-diversity analysis included 242 samples and 196 features./p>90)./p>